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2024-03-29 18:37 《云南中医中药》杂志  主页 > 记忆 > 年份财富 > 名医钜献 > 名医宝 >

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参苓白术散通过Linc01615/miR-491-5p对结直肠癌细胞的影响
 
《云南中医中药》杂志 2024年1期   作者:钟丽娅 赵建政 毛昀 肖佑
 


 




 





摘要:目的 探索参苓白术散通过Linc01615/miR-491-5p对结直肠癌细胞凋亡、细胞周期和侵袭作用的影响。方法 通过细胞转染构建分组:空白对照组、参苓白术散组、参苓白术散组+siRNA Linc01615、参苓白术散组+oe Linc01615、参苓白术散组+miR-491-5p mimics、参苓白术散组+miR-491-5p抑制剂组、参苓白术散组+miR-491-5p mimics+oe Linc01615,加入相应的血清进行干预。经相应的血清处理后,Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期分布情况,transwell实验检测细胞侵袭情况。结果 参苓白术散处理细胞后,抑制细胞增殖、侵袭及细胞周期的G0/G1期并促进凋亡,在分别加入siRNA Linc01615和 miR-491-5p mimics后效果更为显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 参苓白术散可能通过Linc01615/miR-491-5p 抑制LoVo细胞的侵袭,促进凋亡并将细胞周期阻滞于G0/G1期。
 
关键词:参苓白术散;Linc01615;miR-491-5p;结直肠癌
 
中图分类号:R735.3+7
 
文献标志码:A
 
文章编号:1007-2349(2024)01-0079-06
 
Effect of Shenling Baizhu Powder on Colorectal Cancer Cells via Linc01615/miR-491-5p
 
ZHONG Li-ya,ZHAO Jian-zheng,MAO Yun,XIAO You
 
(1. 921 Hospital of Joint Logistic Support Force,Changsha 410000,China;
 
2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine,Changsha 410005,China)
 
【Abstract】Objective: To study the effect of Shenling Baizhu Powder on apoptosis,cell cycle and invasion of colorectal cancer via Linc01615/miR-491-5p. Methods: Groups were constructed by cell transfection and divided blank control group,Shenling Baizhu Powder group,Shenling Baizhu Powder group+siRNA Linc01615,Shenling Baizhu Powder group+oe Linc01615,Shenling Baizhu Powder group+miR-491-5p mimics,Shenling Baizhu Powder group+miR-491-5p inhibitor group,Shenling Baizhu Powder group+miR-491-5p mimics+oe Linc01615. All groups were added to the corresponding serum for intervention. After treatment with the corresponding serum,Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry was used to detect apoptosis and cell cycle distribution,and transwell assay was used to detect cell invasion. Results: Shenling Baishu Powder inhibited cell proliferation,invasion and G0/G1 phase of cell cycle,and promoted apoptosis,and the effect was more significant after the addition of siRNA Linc01615 and miR-491-5p mimics. The difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion: Shenling Baizhu Powder may inhibit the invasion of LoVo cells through Linc01615/miR-491-5p,promote apoptosis and block the cell cycle in G0/G1 phase.
 
【Key words】Shenling Baizhu Powder; Linc01615; miR-491-5p; Colorectal Cancer
 
結直肠癌(colorectal cancer,CRC)是一种常见消化系统癌症,且有越来越多的数据显示,结直肠癌的发病趋向年轻化发展,因此,积极探究结直肠癌发生和发展过程中的异常分子机制,提高患者生存期显得至关重要。参苓白术散应用于CRC治疗领域取得了良好的效果,大量的临床研究显示参苓白术散在增强患者食欲,抑制癌细胞功能,增强机体免疫力等方面占据了重要地位。参苓白术散在肿瘤领域的研究越来越广泛,临床应用疗效颇丰,但在CRC中的实验研究并不多见。
 
Linc01615在多种肿瘤中作为促癌基因对肿瘤细胞生物学行为进行调控。然而在CRC中,Linc01615的表达情况研究尚少。miR-491-5p是一种肿瘤抑制因子,miR-491-5p参与对鼻咽癌、前列腺癌、乳腺癌肿瘤细胞的生物学功能的调节。课题组在前期已对Linc01615/miR-491-5p调控轴进行了研究,发现Linc01615及miR-491-5p 基因表达呈负相关,Linc01615在CRC中作为促癌基因发挥作用,而miR-491-5p作为抑癌基因发挥作用,Linc0165通过调节 miR-491-5p 的表达调控结直肠癌细胞的生物学功能。结合科室临床观察及国内外同行研究成果发现参苓白术散具有抗肿瘤作用,本研究推论参苓白术散可能通过Linc01615/miR-491-5p 途径调控结直肠癌的生物学功能,并深入探索参苓白术散治疗CRC的分子机制。
 
1 材料与方法
 
1.1 实验材料
 
1.1.1 动物 SD雄性大鼠28只,SPF级,体重(235±15)g,许可证号:SCXK(湘)2019-0014,购买于长沙市天勤生物技术有限公司,动物饲养于湖南省中医药研究院。实验通过湖南省中医药研究院实验动物伦理委员会批准(编号:2021-0039)。
 
1.1.2 药物 人参(批号20201201),白术(批号041104),茯苓(批号211001),山药(批号210401),薏苡仁(批号031201),莲子肉(批号211202),陈皮(批号211001),白扁豆(批号210330),砂仁(批号112205),桔梗(批号122404),甘草(批号2110101)。由湖南中医药大学第二附属医院新汇药房提供,质量均符合《中国药典》2020年版标准。
 
1.1.3 试剂 人结直肠癌细胞系LoVo(GENINK),RPMI-1640培养基(Gibco),胰酶Trypsin-EDTA(0.25%)(Gibco),FBS(Gibco),F-12K(Gibco),Lipofectamine2000(invitrogen),Opti-MEM(Gibco),Transwell小室(Corning),Matrigel基质胶(BD),结晶紫染色液(Biosharp),Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(Beyotime),细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(Beyotime),异氟烷(江苏恒丰强)。
 
1.2 实验方法
 
1.2.1 大鼠含药血清的制备 参苓白术散成人临床使用剂量:人参15 g,白术15 g,茯苓15 g,山药15 g,薏苡仁9 g,莲子肉9 g,陈皮9 g,白扁豆12 g,砂仁6 g,桔梗6 g,甘草9 g。根据大鼠与人的剂量换算系数6.3,大鼠给药剂量10.8 g/kg,熬制参苓白术散药液为2 g/mL濃缩液后冰箱内保存,每日使用时提前复温。将28只大鼠随机分为7组,1组为空白组(4只),另6组为给药组(24只)。待适应性喂养3 d后,按照上述计算剂量,给药组每日予参苓白术散灌胃,空白组予等量生理盐水,连续灌胃1周后提取血清。大鼠末次给药1 h后,异氟烷吸入麻醉后经腹主动脉取血,室温静置1 h后,3000rpm离心15 min,置于-80℃冰箱保存备用。
 
1.2.2 细胞转染与分组 取对数生长期LoVo细胞分别用 Lipofectamine 2000 转染oe Linc01615、siRNA Linc01615及miR-491-5p mimics、抑制剂以人为地增强或抑制这些RNA 的表达水平,oe Linc01615 和siRNA Linc01615由赛默飞世尔科技公司提供,miR-491-5pmimics及抑制剂由上海吉凯基因公司提供,转染过程严格按照Lipofectamine 2000试剂说明书进行,再用大鼠血清处理转染后的LoVo细胞溶液24h。转染细胞分组:A:空白对照组;B:参苓白术散组;C:参苓白术散组+siRNA Linc01615;D:参苓白术散组+oe Linc01615,E:参苓白术散组+miR-491-5p mimics,F:参苓白术散组+miR-491-5p抑制剂组,G:参苓白术散组+miR-491-5p mimics+oe Linc01615。
 
1.2.3 流式细胞术检测细胞的凋亡和周期改变 在LoVo细胞中加入 Annexin V-FITC结合液,碘化丙啶(PI)染色液;室温下使用铝箔避光孵育15min,随后置于冰中;染色结束后即刻流式细胞仪检测凋亡情况。另取LoVo细胞加入预冷70%乙醇,4℃保存,固定过夜;样品中加入PI染色液,充分重悬细胞,室温避光孵育30min;流式细胞仪检测,分析细胞周期。
 
1.2.4 Transwell法检测细胞的侵袭情况 提前拿出Matrigel胶融化,变为液态使用;加入到transwell小室底膜的上室面,培养箱中静置2h成胶;取细胞悬液加入到小室中,再在下层小室中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基;结晶紫染色20min,洗去结晶紫,棉签轻缓擦拭小室内侧;显微镜拍照并记录,取3个视野。计算侵袭过基底膜的LoVo细胞数量。
 
1.3 统计学方法 实验数据由SPSS 26统计分析,计量资料用均数±标准差表示,多组间比较若符合正态分布且方差齐时用方差分析,两两比较用LSD检验,方差不齐时用Dunnett’s T3检验;反之用非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
 
2 结果
 
2.1 LoVo细胞形态学的改变 参苓白术散处理细胞后(图1B),细胞数目减少,抑制了细胞生长;在分别加入siRNA Linc01615和 miR-491-5p mimics后抑制效果更为显著(图1C、图1E),说明参苓白术散可以促进LoVo细胞的死亡,抑制linc01615和过表达miR-491-5p会加重细胞死亡进程。详见图1。
 
2.2 流式细胞术检测LoVo细胞的凋亡和周期改变 空白对照组、参苓白术散组、参苓白术散组+siRNA Linc01615、参苓白术散组+miR-491-5p mimics的凋亡率分别为1.2%、10.74%、11.54%、11.67%,参苓白术散组中LoVo细胞的凋亡率增加,且在分别加入siRNA Linc01615和miR-491-5p mimics后凋亡率增加更显著。而在参苓白术散组+miR-491-5p mimics+oe Linc01615组的凋亡率为1.73%,过表达的Linc01615可部分逆转miR-491-5p mimics对LoVo细胞的促凋亡作用。详见图2、3。
 
空白組G1期细胞占比为54.14%,参苓白术散处理细胞后,G1期细胞占比增加至57.48%,抑制了细胞周期的G0/G1期;分别加入siRNA Linc01615和 miR-491-5p mimics后G1期细胞占比上升到63.40%、65.84%,抑制效果更佳显著。详见图4、5。
 
2.3 Tranwell实验检测LoVo细胞的侵袭 与空白组对比,参苓白术散处理细胞后,侵袭细胞数减少(P<0.05);与参苓白术散组相比,分别加入siRNA Linc01615和 miR-491-5p mimics后细胞数明显减少,抑制效果更佳显著(P<0.05),而过表达的Linc01615可阻滞过表达miR-491-5p 对LoVo细胞侵袭功能的抑制。详见图6、7,表1。
 
3 讨论
 
目前,CRC以手术方式为主要治疗手段,术前术后的放疗、化学治疗等为辅助手段。但化疗药物带来的诸如骨髓抑制、胃肠反应等毒副作用仍深深困扰着患者。中医药治疗在促进术后患者康复、增强体质、减少肿瘤转移和复发、减轻放化疗的副作用方面有着独特的优势。结直肠癌患者久病体虚,加上化疗等外来之邪耗伤正气,脾胃不足,所以本虚标实为主要病机特点,健脾扶正、清热利湿抑瘤为主要治疗原则,治疗上多以脾为本。参苓白术散具有健脾补气,渗湿止泻的疗效,此治疗功效也与CRC的中医病机相符。且有实验证明,参苓白术散能增强人结肠癌细胞株HCT116对奥沙利铂的敏感性,并促进人结肠癌细胞株HCT116凋亡,抑制细胞增殖,改变细胞周期。
 
LncRNA在肿瘤进展中的作用已被广泛研究,探寻 lncRNA 在肿瘤进展中的功能,对于肿瘤的早期诊断、靶向治疗及预后评估尤为有意义。最近的一项研究验证了临床和细胞样本中Linc01615在结直肠癌的高表达,Linc01615过表达的患者往往预后不良,这也与我们前期的研究结论相一致。随着基因表达谱研究的不断挖掘,许多生理过程和病理的结果,包括肿瘤等疾病都被发现与miRNA的调控高度相关。在CRC中,Lu等发现miR-491-5p的表达在CRC组织和细胞系中明显下调,且miR-491-5p表达水平与患者TNM分期和总生存期差有关。
 
前期研究发现Linc01615和miR-491-5p在结直肠癌组织中的表达差异,这一结果符合之前的文献报道,且探索出二者的互作具有调控结直肠癌细胞生物学功能,为进一步替该信号通路提供有效的抑制药物,结合我科临床经验及对直肠癌裸鼠模型的预实验,我们选取了参苓白术散进行干预,探索参苓白术散治疗CRC的分子生物学机制。
 
综上所述,本研究显示经参苓白术散干预后,LoVo细胞的增殖被抑制、凋亡增加,细胞的G0/G1周期被阻滞,其次参苓白术散减弱LoVo细胞的侵袭能力,抑制Linc01615或过表达miR-491-5p均可促进参苓白术散对LoVo细胞的调控作用,且过表达Linc01615可部分逆转miR-491-5p模拟剂对参苓白术散处理后的LoVo细胞的调控功能。此次的研究结果至少可以一定程度上阐明调控Linc01615/miR-491-5p信号轴可能是参苓白术散在CRC中发挥抗肿瘤活性的重要途径之一。
 
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(收稿日期:2023-08-25)

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